人转化因子α

TGF-α简介：

转化生长因子α（TGF-α），又称为肉瘤生长因子，是表皮生长因子（EGF）细胞因子家族的成员之一。人类TGF-α基因包含六个外显子，编码160个氨基酸（aa）前体蛋白。前体包含氨基末端、质膜靶向信号序列、具有N-和O-连接糖基化位点的胞外结构域、单个跨膜跨越区和细胞质尾部。人类TGF-α与小鼠和大鼠分别大约有93%的同源性。与其它EGF蛋白家族的成员一样，成熟的可溶性TGF-α在细胞外结构域的羧基末端有一个50 aa的片段。该区域包含几个高度保守的半胱氨酸残基，它们参与分子内二硫键形成一系列环。因为糖基化的变化，成熟的TGF-α的分子量在5-30 kDa之间。

TGF-α通常与其增殖、分化和转化促进作用有关，同时它也参与血管生成、骨吸收、细胞代谢、细胞迁移和伤口愈合。此外，TGF-α不仅与多种癌症有关，还与多种神经退行性疾病有关。TGF-α的

表达以相对广泛的分布为特征。，在正常成人内分泌、造血、免疫、皮肤、神经、呼吸和泌尿系统中被描述。转化生长因子-α在许多类型的转化细胞和肿瘤组织中表达过度。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中TGF-α 的浓度。TGF-α 捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的TGF-α 会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人TGF-α 抗体后，抗人TGF-α 抗体与TGF-α 接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在TGF-α 将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，TGF-α 浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中TGF-α 浓度。

人TGF-α定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集

D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。

注：人血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准确性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3. 如有5×标准品稀释液用双蒸水或去离子水稀释(1份加4份水)。

4.标准品:按标签复溶体积用标准品稀释液复溶使TGF-α终浓度达到500pg/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置15~20分钟后轻轻混匀（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为500 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料：

1. 不同规格的加样枪及相应的枪头；   
2. 酶标仪；
3. 自动洗板机；                     
4. 去离子水或双蒸水；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3. 分别将样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入相应孔中，用封板膜封住反应孔，室温（25-28℃）孵育120分钟。对于血清血浆样本，先加50ul的样本分析缓冲液，再加50uL样本。如检测超出范围，请先加50ul的样本分析缓冲液，再加入用标准品稀释液稀释后的样本50μl检测。请注意记录好样品的稀释倍数，此处加样量50ul相当于已稀释了2倍。     

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育60分钟。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的HRP酶(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。

10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为6.7pg/ml。

2.特异性：与人的Amphiregulin,Betacellulin,EGF,EGF R,HB-EGF,HRG-α等无交叉反应性。

3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.