NF-κB 信号转导相互作用通路荧光定量PCR检测试剂盒
靶基因：NF-kBp50、p52、p65、MyD88、IRAK1/4
规 格：20T/50T
货 号：LJS-SP712
储存条件：避光，-20 ℃，保质2年
产品简介
1、产品用途：本试剂盒用于NF-κB 相对表达量相关研究。
2、本试剂盒包含第一链cDNA合成及逆转录后Real Time RT-PCR所需的各种酶、buffer和特异性引物等各种组分。
3、本产品以提取的总RNA为模板，特别添加了gDNA Remover，在合成第一链cDNA的同时去除RNA模板中基因组来源的DNA残留。逆转录后的cDNA经过稀释后即可使用本试剂盒中包含的2×SYBR Green Mix以及特异性设计的信号通路靶基因荧光定量PCR检测引物进行后续靶基因表达量检测分析。
4、产品特点：本试剂盒为定制产品包含所有靶基因检测的高特异性荧光定量PCR扩增引物及内参引物，所有引物扩增产物熔解曲线峰图为特异性单峰，电泳条带单一。
本试剂盒提供经过特别优化的反应体系和扩增条件，能够提供极佳的检测特异性和扩增效率，检测范围宽，同时适用于高拷贝及低拷贝基因的检测。
试剂盒组成
第一链cDNA合成组分
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Component |
ZN-SP711-01 |
ZN-SP711-02 |
ZN-SP711-03 |
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Oligo dT Primer (0.5 μg/μL) |
10 μL |
20 μL |
50 μL |
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Random Primer (0.5 μg/μL) |
10 μL |
20 μL |
50 μL |
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2×ZN RT Reaction Mix |
100 μL |
200 μL |
500 μL |
|
Script RT/RI znzyme Mix |
10 μL |
20 μL |
50 μL |
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gDNA Remove1* |
10 μL |
20 μL |
50 μL |
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DNase/RNase free ddH2O |
250 μL |
500 μL |
2 mL |
1* gDNA Remove特异性水解双链DNA，在逆转录的同时去除基因组DNA，但又不会水解cDNA中的单链DNA。
PCR组分
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Component |
ZN-SP711-01 |
ZN-SP711-02 |
ZN-SP711-03 |
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2×SYBR Green Premix EX-Taq |
2.5 mL |
5 mL |
12.5 mL |
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ROX Reference I（50×）1* |
100 μL |
200 μL |
500 μL |
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ROX Reference II（50×）23* |
100 μL |
200 μL |
500 μL |
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ddH2O |
2 mL |
4 mL |
10 mL |
1* 为低浓度校正染料，适用于Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real Time PCR System ，ABI Q3/5/6/7/Viia7，Agillent MX3000/3005P/4000P。
2* 为高浓度校正染料，适用于Applied Biosystems 7000/7300/7700/7900/7900Fast/StepOnePlus Real-Time PCR System。
3* 以下机型反应体系不需要添加ROX
Thermal Cycler Dice Real Time System III (CodeNo.TP950/TP970/TP980/TP990)
Thermal Cycler Dice Real Time System Lite（Code No. TP700/TP760）
Smart Cycler System/Smart Cycler II System（Cepheid）
LightCycler96/480 System（Roche）
CFX96 Real-Time PCR System（Bio-Rad）
注：不需要添加ROX的机器，试剂盒中不提供该组分。
Specific primers
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Primers List |
ZN-DZH711-01 |
ZN-DZH711-02 |
ZN-DZH711-05 |
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K-RAS Primer Mix |
30 μL |
60 μL |
150 μL |
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B-RAF Primer Mix |
30 μL |
60 μL |
150 μL |
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MEK Primer Mix |
30 μL |
60 μL |
150 μL |
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ERK1 Primer Mix |
30 μL |
60 μL |
150 μL |
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PI3K Primer Mix |
30 μL |
60 μL |
150 μL |
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PTEN Primer Mix |
30 μL |
60 μL |
150 μL |
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AKT Primer Mix |
30 μL |
60 μL |
150 μL |
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Humo GAPDH Primer Mix |
30 μL |
60 μL |
150 μL |
特别优化的反应体系与条件
逆转录第一链cDNA合成
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Component |
Volume |
Comment |
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Total RNA/mRNA1* |
1-7 μL（500ng~1μg ） |
50 ng-5 μg |
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Oligo dT or Random Primer 9(0.5 μg/μL)2* |
1 μL |
可二选一加入 |
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2×ZN RT Reaction Mix |
10 μL |
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Script RT/RI znzyme Mix |
1 μL |
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gDNA Remove |
1 μL |
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DNase/RNase free ddH2O3* |
to 20 μL |
根据RNA浓度调整 |
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Total Volume |
20 μL |
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1* 推荐RNA用量为500 ng~1μg，该逆转录体系可对50 ng-5 μg宽泛范围内的总RNA进行高效逆转录。
2* Oligo dT or Random Primer 9可以任选一种加入（建议只添加 Random Primer 9即可），也可以根据实际情况2种组分均加入0.5~1 μL。
3* 调整DNase/RNase free ddH2O的体积，使体系最终体积为20 μL。
将以上各组分混匀后，置于42 ℃水浴锅中孵育30 ~60 min，得到第一链cDNA，用ddH2O适当稀释后（cDNA推荐3~10倍稀释），进行后续QPCR反应。
对于复杂模板RNA，建议先将模板RNA、逆转录引物、DNase/RNase free ddH2O先混合（8 μL），65℃热激5 min，再置于冰上孵育3 min，离心后再加入剩余混合体系12 μL。
QPCR反应体系：推荐使用20 μL
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Component |
Volume |
Comment |
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2×SYBR Green Premix EX-Taq |
10 μL |
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Primer Mix1* |
1 μL |
10 μmol/L F/R |
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ddH2O2* |
6.6 μL |
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ROX |
0.4 μL |
选加 |
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cDNA3* |
2 μL |
单独加入各孔 |
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Total Volume |
20 μL |
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1* Primer Mix为上游引物F和下游引物R的等体积混合物，浓度均为正常工作浓度10 μM。
2* 若使用机器不需要添加ROX，则ddH2O加入7 μL。
3* 配制QPCR混合体系mix，18 μL/孔分装，然后再分别加入cDNA模板，2 μL/孔。
QPCR反应条件：推荐使用两步法
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QPCR stage |
Temperature |
Times |
Cycles |
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Preincubation |
94 ℃ |
30 s |
1 |
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Amplification1* |
94 ℃ |
5 s |
40 |
|
61 ℃ 2* |
35 s 3* |
||
|
Melting |
98 ℃ |
10 s |
1 |
|
65 ℃ |
60 s |
||
|
98 ℃ |
1 s |
1* 为保证PCR检测的特异性，本产品推荐使用2步法扩增。
23* 退火延伸的温度和时间是本试剂盒根据特异性设计靶基因引物的特性，经过优化而设定的，请勿随意更改。
注意事项
1、逆转录过程尽量避免RNase污染，所有使用的离心管及吸头都应为RNase-free。
2、尽可能使用高质量的RNA模板，为了提高后期检测质量，逆转录RNA用量尽量不低于500 ng，推荐500 ng~1 μg。
3、当逆转录样本量较多时，推荐先配制除RNA模板及DNase/RNase free ddH2O以外的混样，然后再分装至各样本。
4、酶、buffer及各种引物尽可能避免反复冻融，融化后应彻底混匀后再吸取，使用时各组分全程冰盒上操作。
